Dr. Federica Rizzo, Dr. Stefania Corti, Prof. Giacomo P. Comi
Centro Dino Ferrari Università degli Studi di Milano

La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivo-motoria, caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni motori e sensitivi, che risulta in una progressiva debolezza agli arti, atrofia muscolare e perdita della sensibilità. La patologia è dovuta a mutazioni nel gene Mitofusina 2 (MFN2), che codifica per una proteina localizzata a livello dei mitocondri, essenziale per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto funzionamento. Ad oggi, purtroppo non esistono terapie risolutive per questa patologia. Obbiettivo del nostro progetto è di sviluppare un’efficace terapia, attraverso la conoscenza dei meccanismi responsabili della malattia, utili per identificare nuovi bersagli terapeutici, ma anche per definire biomarcatori del fenotipo patologico.
In questo progetto, abbiamo inizialmente reclutato e sottoposto a biopsia cutanea pazienti CMT2A con diverse mutazioni nel gene MFN2 in modo da ottenere fibroblasti pazienti specifici. La riprogrammazione di queste cellule mature in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre la possibilità di ottenere cellule paziente specifiche, come motoneuroni e neuroni sensitivi umani, tipicamente affetti nella patologia, ma impossibili da ottenere con altre strategie. In questo modo, abbiamo generato un modello in vitro di malattia, attualmente non disponibile. Sfruttando questa metodica, abbiamo ottenuto diverse linee di iPSC da pazienti CMT2A e abbiamo dimostrato il differenziamento in motoneuroni paziente specifici. Le cellule così ottenute hanno mostrato alcuni aspetti tipici della patologia, come la alterazioni della localizzazione dei mitocondri, riduzione della quantità del DNA mitocondriale e dell’attività dei complessi della catena respiratoria. Questi difetti sono risultati più evidenti nelle cellule neuronali rispetto ai fibroblasti, in accordo con la specificità neuronale della patologia.
Accanto ai modelli in vitro, abbiamo condotto le analisi degli stessi aspetti anche nell’unico modello murino attualmente disponibile di CMT2A (MitoCharc 1), per ampliarne la caratterizzazione alla ricerca di biomarcatori del fenotipo patologico.

In parallelo, ci siamo focalizzati sullo sviluppo di un approccio terapeutico per questa patologia. A questo proposito, abbiamo silenziato il gene MFN2 endogeno mediante short harpin RNA (shRNA) nei fibroblasti CMT2A. In parallelo, nelle stesse cellule, per recuperare i normali livelli di espressione del gene MFN2, abbiamo introdotto il c-DNA del gene MFN2 modificato in modo da resistere al processo di silenziamento. I risultati ottenuti con questa strategia nei fibroblasti CMT2A sono stati molto promettenti e ci hanno permesso di ottenere alcuni dati preliminari anche nel modello murino.
Questo studio ha contribuito ad approfondire i meccanismi molecolari patogenetici attraverso la generazione di un modello in vitro di CMT2A con iPSC paziente specifico e di identificare una possibile strategia terapeutica per la CMT2A.

Gli sviluppi futuri del nostro progetto di ricerca sono finalizzati a:
-aumentare il numero di linee di iPSC ottenute da pazienti con altre mutazioni nel gene MFN2 da differenziare successivamente in neuroni
-testare la nostra strategia terapeutica nei neuroni ottenuti dai pazienti
-applicare questa terapia nel modello murino della patologia attraverso l’utilizzo di vettori adeno-virali di tipo 9, capaci di trasferire specifiche molecole all’interno dei cellule neuronali, tipicamente coinvolte nella patologia.

Recentemente, in associazione a questi approcci, abbiamo progettato di testare un’innovativa tecnica di “genome editing”, ovvero un sistema di correzione della mutazione responsabile della malattia direttamente a livello del DNA. In particolare, il sistema che stiamo studiando è il CRISPR-CAS9, che deriva da un meccanismo di difesa immunitaria presente nei batteri, che ha promettenti potenzialità applicative nella correzione del DNA umano, come testimoniato dai numerosi riconoscimenti/premi scientifici attribuiti a questa scoperta nell’ultimo anno. Questa tecnologia si basa su un sistema che comprende una stringa guida complementare alla sequenza di DNA d’interesse, accoppiata ad un specifico enzima che ha la funzione di tagliare in maniera specifica il DNA. Il sistema permette, quindi, di legare specificatamente la sequenza di DNA in cui è presente la mutazione e di tagliarla grazie all’azione dell’enzima. Sulla base dei risultati soddisfacenti ottenuti in altre patologie, abbiamo pensato di applicare questa tecnica alla CMT2A per rimuovere la sequenza di DNA in cui è presente la mutazione responsabile della patologia, sostituendola direttamente con la sequenza di DNA corretta, permettendo quindi un ripristino corretto del gene mutato.
Questa strategia potrà essere sviluppata per un’applicazione terapeutica in trial clinici in pazienti.